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2.1 前言
2.1.1 马兜铃酸性质
马兜铃酸是一大类硝基菲类有机酸化合物，包括马兜铃酸 A、B、C、D以及马兜铃内酞胺等等。存在于马兜铃属及细辛属等马兜铃科植物中，而这些植物曾广泛地被中医作为原生药材入药，依靠吸食这类植物生存的蝴蝶体内也有马兜铃酸。
2.1.2 马兜铃酸结构
图2-1 马兜铃酸结构式
2.1.3 马兜铃酸危害
马兜铃酸类化合物中，主要的毒性成分为马兜铃酸A或其代谢物马兜铃内酞胺，硝基是马兜铃酸类衍生物中最主要的毒性基团，此外甲氧基和羟基的存在可以使马兜铃酸的毒性进一步加强。另有研究发现，不但马兜铃酸具有很强的肾毒性，其代谢产物马兜铃内酰胺同样具有肾毒性。又通过对马兜铃酸代谢过程及代谢酶的研究证实，马兜铃酸可使RAS基因和P53基因发生突变，进而诱发肿瘤。因此需要对马兜铃酸进行进行检测。
2.1.4 检测方法
拉斯维加斯注册秒送39结合GB/T 35949-2018《化妆品中禁用物质米马兜铃酸A的测定高效液相色谱法》提出了针对膏霜、乳液、化妆水等皮肤护理类化妆品中马兜铃酸A分析的全套解决方案。相关人员可参考本实验中的方法，进行化妆品中马兜铃酸A的测定。
2.2 仪器设备与试剂
表2-1(a) EClassical 3100型高效液相色谱系统设备标准配置清单
|
序号 |
名称 |
数量 |
订货号 |
|
1 |
UV3100紫外-可见检测器 |
1台 |
31020023 |
|
2 |
P3100高压恒流泵 |
1台 |
31010047 |
|
3 |
O3100色谱柱恒温箱(选配) |
1台 |
31040010 |
|
4 |
Rheodyne 7725i高压六通进样阀 |
1个 |
32027725i |
|
5 |
ZJ-1阀支架 |
1个 |
18050004 |
|
6 |
Chromsoft色谱数据工作站 |
1套 |
|
|
7 |
TD-1-15梯度混合器(选配) |
1个 |
31060001 |
|
8 |
TP3100溶剂托盘 |
1台 |
|
|
9 |
SupersilODS2 5μm4.6×250mm色谱柱 |
1支 |
|
|
10 |
S3100自动进样器(选配) |
1台 |
31090005 |
|
11 |
DG3100在线脱气机(选配) |
1台 |
31050006 |
表2-1(b) iChrom 5100型高效液相色谱系统设备标准配置清单
|
序号 |
名称 |
数量 |
订货号 |
|
1 |
D5101紫外-可见检测器 |
1台 |
31020022 |
|
2 |
P5101高压恒流泵 |
1台 |
31010041 |
|
3 |
O5100色谱柱恒温箱(选配) |
1台 |
31040009 |
|
4 |
Rheodyne 7725i高压六通进样阀 |
1个 |
32027725i |
|
5 |
VB5101阀支架 |
1个 |
18050012 |
|
6 |
Chromsoft色谱数据工作站 |
1套 |
|
|
7 |
M5101系统组织器 |
1台 |
31080009 |
|
8 |
AD适配器 |
1台 |
31030024 |
|
9 |
Supersil ODS25μm4.6×250mm色谱柱 |
1支 |
|
|
10 |
S5101自动进样器(选配) |
1台 |
31090004 |
|
|
P5102高压恒流泵（选配） |
|
|
|
11 |
M5102系统组织器(选配) |
1台 |
31080010 |
注：或同等配置的其他型号的高效液相色谱仪
表2-2 主要化学试剂、标准品清单
|
序号 |
试剂 |
纯度 |
|
1 |
甲醇 |
色谱纯 |
|
2 |
去离子水 |
18.2MΩ |
|
3 |
冰醋酸 |
分析纯 |
|
4 |
马兜铃酸A |
阿拉丁 |
表2-3 主要样品前处理设备
|
名称 |
规格型号 |
备注 |
|
|
1 |
溶剂过滤器 |
1000mL |
流动相过滤 |
|
2 |
隔膜真空泵 |
0.08MPa,160W |
流动相过滤，GM-0.33A |
|
3 |
超声清洗器 |
3L/6L, 40/60KHz, 120W |
流动相脱气，AS3120 |
|
4 |
精密电子天平 |
感量为万分之一 |
称量 |
|
5 |
离心机 |
3K-15 |
SIGMA |
实验过程中其它玻璃器皿还包括容量瓶(100mL、50mL、25mL、10mL)、移液枪(0～1000µL，0～5000µL)、移液枪枪头(1mL，5mL)、一次性PVC手套、一次性口罩、进样针、滤膜等若干。
2.3 实验方法
2.3.1 标准溶液配制
马兜铃酸A标准储备液(100μg/mL)：取马兜铃酸标准品约5mg置于50mL容量瓶中，用甲醇定容。
马兜铃酸A标准工作液：用流动相配制浓度分别为1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL的马兜铃酸A标准工作液。
2.3.2 样品前处理
称取化妆品约1.0g（精确至0.0001g），置于50mL离心管中，精密加入甲醇10mL，超声提取20min，5000r/min离心15min后，上清液经0.45µm微孔滤膜过滤，备用。
2.3.3 色谱条件
流动相：甲醇:0.5%冰醋酸水溶液=70:30(V:V)
色谱柱：Supersil ODS2 5μm 4.6×200mm
流速：1.0mL/min
检测波长：315nm
进样量：20µL
柱温：30℃
2.4 实验结果
2.4.1. 典型分离色谱图
进样分析浓度为20μg/mL的马兜铃酸A标准工作液，使用2.3.3中的色谱条件，结果如下图所示。
图2-4 马兜铃酸A标准溶液色谱图
表2-4 色谱参数
|
物质 |
保留时间(min) |
峰面积(mV.sec) |
不对称度 |
塔板数(N/m) |
|
马兜铃酸A |
11.35 |
1039.77 |
1.18 |
43600 |
从以上结果可知，马兜铃酸A分析速度快，不对称度好，柱效高，故该方法适合于马兜铃酸A的分析。
2.4.2. 线性与检出限
将马兜铃酸A标准工作溶液，按2.3.3中色谱条件进行分析，马兜铃酸的线性方程及检出限如下表所示。
表2-5 线性方程
|
物质 |
线性方程 |
线性相关系数R |
|
马兜铃酸A |
y =53.7433x -18.1652 |
0.9999 |
从上表可知，马兜铃酸A浓度在1.0μg/mL到50μg/mL线性范围内线性相关系数大于0.999。
以3倍信噪比对应的浓度换算为仪器的检出限，以10倍信噪比对应的浓度为仪器的定量限，结果如下表所示。
表2-6 检出限对比
|
|
方法检出限(mg /kg) |
方法定量限(mg /kg) |
GB/T 35849-2018检出限(mg/kg) |
GB/T 35949-2018定量限(mg/kg) |
|
马兜铃酸A |
0.29 |
0.96 |
0.30 |
1.00 |
从以上结果可知，本系统的马兜铃酸A检测的灵敏度明符合国标中的要求，即符合检测要求。
2.4.3. 方法准确性与重复性
在添加浓度5.0μg/mL~20.0μg/mL的浓度范围内，测得回收率82.3%～90.6%，相对标准偏差为1.3%～2.9%。
表2-7 化妆品中马兜铃酸A方法准确性与重复性结果
|
加标浓度(μg/mL) |
平行样品 |
实测值（μg/mL） |
加标回收率(%) |
重复性(RSD%) |
|
5.0 |
1 |
4.36 |
87.1 |
2.9 |
|
2 |
4.19 |
83.8 |
||
|
3 |
4.12 |
82.3 |
||
|
20.0 |
1 |
18.13 |
90.6 |
1.3 |
|
2 |
17.68 |
88.4 |
||
|
3 |
18.07 |
90.4 |
2.4.4. 实际样品
市场购化妆品，按本文中提到的方法进行了分析，结果如下所示。
图2-5 实际样品谱图
表2-7 实际样品
|
马兜铃酸A |
浓度(mg/L) |
含量(mg/kg) |
|
化妆品 |
未检出 |
未检出 |
2.5 参考文献
[1]GB/T 35949-2018《化妆品中禁用物质米马兜铃酸A的测定高效液相色谱法》。
周一至周日 8:30-17:30
（仅收市话费）
